Fa'atonu e Peter Sarnow, Stanford University School of Medicine, Stanford University, Kalefonia, fa'amaonia ia Tesema 25, 2020 (toe iloilo ia Oketopa 25, 2020)
Matou te lipotia le fegalegaleaiga i le va o subunits i le toe faia o coronaviruses-transcription complexes, lea e taua mo le toe faia ma le faʻasaoina o le evolusione.Na matou tuʻuina atu faʻamaoniga o le NiRAN domain e fesoʻotaʻi ma le nsp12 o loʻo i ai le nucleoside monophosphate (NMP) faʻaliliuga gaioiga i le trans, ma faʻamaonia le nsp9 (se RNA fusifusia porotini) e fai ma ana sini.O le NiRAN na te faʻapipiʻiina le faʻapipiʻi faʻapipiʻi o le vaega NMP i le nsp9 amino faʻasao i se tali e faʻalagolago i ion Mn2 + ma toega Asn faʻasaoina lata ane.Na maua o le gaioiga a le NiRAN ma le nsp9 NMPylation e manaʻomia mo le toe faia o le coronavirus.O faʻamaumauga e mafai ai ona matou faʻafesoʻotaʻi lenei gaioiga o le faʻailoga o le enzyme virus faʻailoga i faʻamatalaga talu ai i le manatu o le amataina o le RNA synthesis i se vasega o RNA viruses e faʻatino ma faʻasolosolo faʻasolosolo.
O le RNA-faalagolago RNA polymerase (RdRps) o Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae, ma 12 isi aiga) e fesoʻotaʻi ma le amino-terminal (N-terminal) domain i le non-structural protein (nsp) faʻasaʻoloto mai le polyprotein, e taʻua o le NiRAN. 1ab o loʻo aofia ai viral protease autu (Mpro).I le taimi muamua, o le siama o le arterial NiRAN-RdRp nsp's lava GMPylation / UMPylation gaioiga na lipotia, ma sa fautuaina e faʻatupuina se taimi mo le fesiitaiga o le nucleoside monophosphate (NMP) i le virus (le iloa nei) ma / poʻo mea biopolymerization cell.O iinei, matou te faʻaalia ai o le coronavirus (Human Coronavirus [HCoV]-229E ma Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) o loʻo i ai Mn2 +-faʻalagolago i le NMPylation, lea e maua mai i le nsp9 e ala i le faʻavaeina o le Mpro-mediated nsp9 Ina ua uma. o le N-terminal flanking nsps o loʻo faʻasaʻolotoina, o le phosphoramidate e faʻapipiʻiina i le amine muamua (N3825) i le N-terminal o le nsp9.O le uridine triphosphate o le nucleotide e sili ona lelei i lenei tali, ae o le adenosine triphosphate, guanosine triphosphate, ma le cytidine triphosphate o loʻo fetaui lelei foʻi ma faʻavae.O su'esu'ega suiga e fa'aogaina ai le coronavirus recombinant nsp9 ma le nsp12 proteins ma fa'ainisinia fa'ainisinia HCoV-229E mutants na iloa ai toega e mana'omia mo le NiRAN-mediated nsp9 NMPylation ma le virus replication i le aganuu cell.O faʻamaumauga na faʻamaonia ai le vavalo o toega o le nofoaga galue a NiRAN ma faʻamautu ai le taua o le nsp9 N3826 toega i le nsp9 NMPylation ma le faʻasologa o siama i vitro.O lenei toega o se vaega o le N-terminal NNE tripeptide sequence ma faʻamaonia e naʻo le pau lea o le toega o le nsp9 ma ona homologs i le aiga coronavirus.O lenei suʻesuʻega e maua ai se faʻavae mautu mo le suʻesuʻeina o galuega a le NMPylation o isi faʻamaʻi faʻamaʻi ma faʻatulagaina ni faʻamoemoega talafeagai mo le atinaʻeina o vailaʻau antiviral.
Nidovirales positive-stranded RNA virus e aafia ai le tele o vetebrates ma invertebrates (1, 2).O le fa'atonuga i le taimi nei e aofia ai aiga e 14 (3), lea na su'esu'eina tele ai le aiga o Coronavirus i le 20 tausaga talu ai.I lena taimi, e tolu zoonotic coronaviruses na aliaʻe mai manu ma mafua ai le tele o faʻamaʻi pipisi o faʻamaʻi pipisi i tagata.E aofia ai fa'ama'i faifai pea e mafua mai i fa'ama'i pipisi tuga.Ma'i Fa'amama Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4ââ7).E fa'asoa e Nidoviruses se fa'alapotopotoga fa'a-genome masani, ma o le vaega laiti o le membrane-bound replication-transcription complex (RTC) o lo'o fa'ailogaina i le 5-?²-terminal lua vaetolu ma le vaega autu fa'avae o le siama, fa'apea fo'i ma isi mea fa'aoga. .Polotini, fa'ailoga i le 3??² faai'u lona tolu o le genome (1).Vagana ai le tasi aiga o fa'ama'i planarian (Monoviridae) (8), o fa'ama'i fa'amoega uma e fa'aigoa vaega laiti o le RTC i fa'avaa faitau tetele e lua (ORF) ORF1a ma le ORF1b, lea e fa'aliliu mai le genomic RNA o.O le ORF1a o loʻo faʻapipiʻiina le polyprotein (pp) 1a, ma le ORF1a ma le ORF1b faʻapipiʻi faʻatasi le pp1ab.Faatasi ai ma le auai lautele o le protease autu (Mpro) faʻapipiʻiina e le ORF1a, o le pp1a ma le pp1ab o loʻo faʻapipiʻiina i le tele o palatini e le faʻatulagaina (nsps), e lauiloa foi o le 3CLpro, aua o loʻo i ai le homology ma le 3Cpro o le picornavirus ( 9).O nei nsps e manatu e faʻapipiʻiina i totonu o se RTC malosi tele, faʻapipiʻiina le faʻasologa o le genomic RNA (replication) ma se seti o le subgenomic RNA (transcription), ma faʻaaogaina e faʻamaopoopoina le faʻaaliga o le ORF o loʻo i lalo ole ORF1b (10? ? ?12).
O le RTC autu e aofia ai le RNA-faʻalagolago i le RNA polymerase (RdRp) (13), superfamily 1 helicase (HEL1) (14, 15) ma le tele o enzymes e faʻaogaina ai le RNA, lea e masani ona faʻaogaina i le ORF1b ma le aiga coronavirus O loʻo i ai le nsp12-nsp16 ma nsp9-nsp12 i le aiga Arterioviridae (silasila i le faasinomaga 10ââ 12).O le RdRp ma le HEL1 o lo'o fa'atusalia ai vaega e lua (tasi-lima) fa'asao o le fa'ama'i o le ofaga a le manulele ma e iai fa'ama'i fa'atasi ma isi fa'ama'i RNA.O lo'o iai le talitonuga e fesoasoani le fa'atusa autu e isi vaega laiti, e aofia ai le tele o nsps laiti na tu'uina mai le vaega o le carboxy-terminal (C-terminal) o le pp1a, i lalo ifo o le Mpro (coronavirus nsp5 ma arterial virus nsp4, fa'asologa).E fa'atapula'aina a latou puipuiga fa'apitoa mo aiga ma fa'agaioiga eseese (toe iloilo i le fa'amatalaga 10ââ12).
Talu ai nei lava, na maua ai se vaega fa'atasi ai ma uiga fa'atupu fa'asologa tulaga ese i le amino terminal (N-terminus) e lata ane i le RdRp i fa'ama'i fa'amoega uma, ae leai se isi fa'ama'i RNA (16).Faʻavae i luga o lona nofoaga ma le nucleotide transferase (nucleoside monophosphate [NMP] transferase) gaioiga, o lenei vaega ua faaigoaina o le NiRAN (Nestvirus RdRp-related nucleotide transferase).O le tu'ufa'atasiga lua o le NiRAN-RdRp e aofia ai le nsp12 i le aiga o Coronaviridae ma le nsp9 i le aiga o Arterioviridae, ma i isi nestoviridae, o le NiRAN-RdRp e tatau ona fa'asa'olotoina o se nsp tuto'atasi mai le polyprotein viral.I le coronavirus, o le NiRAN domain o loʻo i ai ??1/450 toega ma e fesoʻotaʻi i le C-terminal RdRp domain e ala i le fesoʻotaʻiga itulagi (16?19).I le Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae), o le recombinant nsp9 o loʻo faʻaalia ai le Mn2 + ion-dependent (self) UMPylation ma le GMPylation gaioiga, lea e faʻalagolago i faʻavae faʻasologa faʻasao e tolu i le nestovirus, AN, BN ma CN O toega i le faasologa.O fea N e tu mo NiRAN) (16).O le pito o le N-terminal o nei fa'autu ose fa'amu'aga e le fa'asao preAN.O nisi o nei toega o loʻo faʻasaoina foʻi i kinases protein mamao, lea na faʻaalia ai le aʻafia i le nucleoside triphosphate (NTP) fusifusia ma catalytic gaioiga (20, 21).E tusa ai ma lenei faʻamatalaga, e mafai ona faʻapipiʻiina le tele o toega o loʻo galue i le pseudokinase SelO mai le Pseudomonas syringae ma le SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 supercomplex talu ai nei.Fa'asaoina le Coronavirus NiRAN toega o lo'o fa'apipi'iina i le fa'aeletonika microstructure.Recombinant porotini (17).O loʻo faʻapea o le faʻamaumauga (tagata lava) U / GMPylation o le a maua ai se tulaga le tumau e faʻafeiloaʻi le NMP i le (16 le iloa nei) substrate (16), ma le fausaga tutusa i le va o le NiRAN ma le protein kinase (17, 19) ) O le manatu e faapea E suia e NiRAN isi polotini.
O le tele o vaega, e aofia ai lona tulaga tulaga ese ma le tulaga ese faiga faʻapipiʻi faʻatasi ma faʻamaʻi faʻapipiʻi ma le vavaeeseina o kenera mai le RdRp, ua avea ai le NiRAN ma se enzyme faʻatonutonu autu talafeagai mo faʻamaʻi faʻapipiʻi, lea e taua i lo latou tulaʻi mai ma faʻamatalaga.I le taimi muamua, e tolu galuega talafeagai e aofia ai le NiRAN e faʻatonutonu le genome / subgenomic faʻaliliuga poʻo le kopi / faʻaliliuga na valaʻau.Pe a iloiloina le utiuti ma le le atoatoa o faʻamatalaga o loʻo maua i le taimi, o galuega taʻitasi e iai ona lelei ma faʻaletonu (16).I lenei suʻesuʻega, matou te faʻamoemoe e tuʻufaʻatasia suʻesuʻega faʻasolosolo ma suʻesuʻega faʻasolosolo o le coronavirus o loʻo fai ma sui o le genera e lua, ma tuʻu a matou suʻesuʻega i le faʻafouina o le suiga faʻanatura o le aiga coronavirus, ina ia maua ai le malamalama i lenei malo lilo.Matou te lipotia le alualu i luma tele i le malamalama o le NiRAN e ala i le faailoaina o sini masani i le RTC, lea (i totonu o manatu e tolu o loʻo avanoa) e saofagā i le matafaioi a lenei vaega i le amataina o le tuʻufaʻatasiga o le virus nested RNA.O lenei suʻesuʻega e tatala ai foʻi avanoa mo isi matafaioi a le NiRAN i luga o le faʻaogaina o le virus host interface.
Ina ia mafai ona faʻaalia uiga faʻamaʻi o le corona virus nsp12 e fesoʻotaʻi ma le NiRAN domain, na matou gaosia se ituaiga faʻafouina o tagata coronavirus 229E (HCoV-229E) nsp12 i E. coli, faʻatasi ai ma le his6 tag i le C-terminus, ma tuʻufaʻatasia le polotini ma le [α32-P ] Fa'asusu fa'atasi ma le NTP i luma o le MnCl2 e pei ona fa'amatalaina i Mea ma Metotia.O le auʻiliʻiliga o le gaioiga faʻaalia o loʻo faʻaalia ai le i ai o se polotini faʻasalalau faʻasalalau faʻatasi ma le nsp12 (106 kDa), e faʻaalia ai o le coronavirus nsp12 e faʻamalosia ai le faʻavaeina o mea faʻapipiʻi protein-NMP, e sili ona faia i le uridine monophosphate (UMP) (Ata 1A) Ma B).O suʻesuʻega faʻatusatusa na faʻaalia ai pe a faʻatusatusa i isi nucleotides, o le faʻailoga malosi o le faʻapipiʻiina o le UMP na faʻateleina i le 2 i le 3 taimi (Ata 1C).O nei faʻamatalaga e ogatasi ma le galuega faʻafeiloaʻi a le NMP o le NiRAN domain o le coronavirus (16), ae o loʻo faʻaalia ai e eseese mea e fiafia i ai nucleotide o le NiRAN domain o le coronavirus ma le siama faʻamaʻi.
Gaoioiga NMPylation a le tagata lava ia HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) sa incubated i le filifilia [α-32P] NTP i luma o le 6 mM MnCl2 mo 30 minute (tagai Mea ma Metotia mo auiliiliga).O mea fa'aalia na tu'u'ese'ese e le SDS-PAGE ma fa'ailogaina i le Coomassie susulu lanumoana.(B) O le polotini ua fa'aigoaina i le leitio o lo'o va'aia e ala i ata fa'akomepiuta.O tulaga o le nsp12-His6 ma le protein molecular mass markers (i kilodaltons) o loʻo faʻaalia i le A ma le B. (C) O le malosi o le faʻailoga leitio (mean ± SEM) na faʻamoemoeina mai suʻega tutoatasi e tolu.*P≤0.05.Ole malosi ole fa'ailoga (pasene) e feso'ota'i ile UTP.
E ui lava ina fa'aalia le fa'aogaina ole enzyme e feso'ota'i ma NiRAN mo le toe faia o le EAV ma le SARS-CoV ile aganu'u (16), o le galuega fa'apitoa a le NiRAN ma fa'amoemoega fa'amoemoe e le'i fa'amautuina.O le faʻataʻitaʻiga talu ai nei lipotia foliga tutusa i le va o le NiRAN ma se aiga o polotini ma polotini kinase-pei gaugau (17, 22) faʻaosofia i matou e faʻataʻitaʻi le manatu o NiRAN faʻamalosia le NMPylation o isi polotini.Na matou fatuina se seti o faʻamoemoega tutusa, e aofia ai polotini e le faʻatulagaina e le HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), e tofu ma le C-terminal His6 tag (SI appendix, Table S1) , Ma fa'asusu nei polotini i le [α32-P] uridine triphosphate ([α32-P]UTP) pe a iai pe leai se nsp12.Bovine serum albumin ma le MBP-LacZα fusion protein na gaosia i le E. coli na avea ma pule (Ata 2A, laina 1 i le 7).Na su'esu'eina le polotini ua fa'aigoaina e le sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) ma le autoradiography, ma na maua ai sa i ai se fa'ailo malosi o le leitio i le tali o lo'o i ai le nsp12 ma le nsp9.O le tulaga o le faailo e fetaui ma le mole mole o le nsp9, e faʻaalia ai le nsp12-mediated UMPylation o le nsp9 (Ata 2B, ala 7).E leai se isi suʻega suʻega na maua e UMPylated, lea na mafua ai ona matou faʻamaonia o le nsp9 o se mea faʻapitoa o le nsp12.E ogatasi ma faʻamaumauga a le tagata lava ia NMPylation o loʻo faʻaalia i le Ata 1, e mafai e le nsp12 ona faʻafeiloaʻi uma NMP e fa i le nsp9, e ui lava e ese le lelei, UMP> adenosine monophosphate (AMP)> guanosine monophosphate (GMP)> cytidine monophosphate (CMP) ) ( Ata).3 A ma le B).I lalo o tulaga o loʻo faʻaaogaina i lenei suʻega (faʻapuupuu le tali ma le taimi faʻaalia, faʻaitiitia le faʻaogaina o le nsp12; meafaitino ma metotia), e le mafai ona iloa le NMPylation o le nsp12 (faʻatusatusa le Ata 2B, laina 7, ma le Ata 1B), lea. faʻamaonia se aoga (Ma le tele o taamilosaga) UMP na siitia mai le nsp12 i le nsp9.UMP transferase gaoioiga e manaomia ai le i ai o Mn2 + ion, e pei ona faaalia i le Ata 3C, ae na o le itiiti lava gaoioiga transferase UMP na matauina i le i ai o Mg2 +, ma e leai se gaoioiga i luma o isi lua divalent cations tofotofoina.O faʻamatalaga tutusa na maua i suʻega NMPylation e aofia ai le cytidine triphosphate (CTP), guanosine triphosphate (GTP), ma le adenosine triphosphate (ATP) (SI faʻapipiʻi, Ata S1).
HCoV-229E nsp12-mediated UMPylation o nsp9.O se faasologa o mea e fai ai porotini (e aofia ai le albumin serum bovine, MBP-lacZα, ma se faasologa o HCoV-229E nsps ua faailogaina i le C-terminal His6 ua fa'ailogaina e le ORF1a) na fa'aaogaina e iloilo ai le gaioiga UMPylation a HCoV-229E nsp12-His6⁺-mediated. polotini.Fa'asusu le polotini i le [α-32P] UTP mo le 10 minute i le toesea (A) poʻo le i ai (B) o le nsp12 e pei ona faʻamatalaina i mea ma metotia.I le pito i luga ole A ma le B, ole SDS-polyacrylamide gel ua pisia ile Coomassie Brilliant Blue o loʻo faʻaalia, ma ile pito i lalo ole A ma le B, o loʻo faʻaalia ai le autoradiograms tutusa.O le tulaga o le polotini mole mole mass maka (i kilodaltons) o loʻo tuʻuina atu i le agavale.O le tulaga o le nsp12-His6 (B, pito i luga) ma le faʻailoga leitio na matauina i le taimi o le incubation o le nsp12-His6 ma le nsp9-His6 (B, lane 7) o loʻo faʻaalia foi, lea e faʻaalia ai le [α-32P]UMP i le nsp9-His6 (12.9 kDa), e leʻi matauina mo isi polotini na suʻeina.
HCoV-229E NiRAN-mediated biochemical and virological characterization of nsp9 NMPylation.(A ma le B) Le matafaioi a le nucleotide co-substrate faʻaaogaina i le gaioiga.Nsp12-His6 ma nsp9-His6 o loʻo faʻafefiloi ma faʻapipiʻiina i luma o le eseʻese [α-32P] NTPs i le suʻega NMPylation masani.(A, pito i luga) Coomassie-pisa nsp9-His6 vavaeeseina e SDS-PAGE.(A, lalo) Autoradiograph o le vaega tutusa o le gel.(B) O le gaioiga faʻatatau (o lona uiga ± SEM) i le i ai o le nucleotide cofactor ua filifilia e faʻamoemoeina mai suʻega tutoatasi e tolu.*P≤0.05.(C) Le matafaioi a ion uamea.O loʻo faʻaalia le suʻega NMPylation masani i le i ai o le [α-32P] UTP ma ion uʻamea eseese, taʻitasi ma le faʻatonuga o le 1 mM.I C, pito i luga, Coomassie stained nsp9-His6 o loʻo faʻaalia, ma i C, pito i lalo, o loʻo faʻaalia le autoradiography talafeagai.O le lapo'a o le polotini ua fa'ailogaina (i kilodaltons) o lo'o fa'aalia i le agavale o le A ma le C. (D) O le mutant form of HCoV-229E nsp12-His6 o lo'o tauaveina le sui amino acid fa'apitoa o lo'o i le [α-32P]UTP, e pei ona faamatalaina. i Mea ma Metotia.O le radiolabeled nsp9-His6 na gaosia i le NMPylation reaction e iloa e le phosphorylation imaging (D, pito i luga).O le gaioiga fa'atusatusa pe a fa'atusatusa i le vao-ituaiga (wt) polotini o lo'o fa'aalia i le D, ma le pito i lalo o le averesi (± SEM) mai le tolu fa'ata'ita'iga Tutoatasi.Asterisk o lo'o fa'aalia ai suiga o toega e le o fa'asaoina.(E) Ole titer ole virus ile supernatant culture ole sela p1 na maua ile 24 itula talu ona fa'amauina le fa'ama'i ile su'esu'ega plaque.O suiga o le codon i le vaega o le NiRAN o le mutant HCoV-229E ua fa'ainisinia o lo'o fa'aalia (fa'ailoga o totoe e fa'atatau i lo latou tulaga i le pp1ab).O le RdRp fa'agaoioi nofoaga fa'agaoioi le toe faia o le mutant nsp12_DD4823/4AA na fa'aaogaina e fai ma pule.
Ina ia maua se malamalama loloto atu i le nofoaga galue o NiRAN ma fuafua ai toega e fesoʻotaʻi ma le gaioiga a le nsp9-specific NMP transferase, matou faia suʻesuʻega mutation, lea na matou suia ai le toega faʻasao i le NiRAN AN, BN ma CN motifs ( 16) O Ala (SI fa'aopoopo, Ata S2).E le gata i lea, o le aʻafiaga o Arg-to-Lys conservative poʻo Lys-to-Arg suitulaga na iloiloina i ni mataupu se lua.I le avea ai o se fa'atonuga (le lelei), o toega e le o fa'asaoina pe itiiti ifo i le NiRAN vaega o coronaviruses ma isi fa'ama'i fa'amoe ua suia i Ala. Suia K4116A (i le motif preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motif). BN) ma le D4280A (CN) e faʻaitiitia pe faʻaitiitia ai le nsp9 NMPylation e ala i le nsp12, ae o polotini faʻatasi ai ma sui faʻasao (R4178K), K4116R) o loʻo taofia le 60% ma le 80% o la latou gaioiga, lea e faʻaalia ai le faʻamalieina o tapulaʻa i o latou itu. filifili e ma'ale'ale physicochemically (Ata 3D).O le suia o isi toega fa'asao E4145A, D4273A, F4281A ma le D4283A e sili atu le leaga, ma o le nsp9 UMPylation e na'o le fa'aitiitia.Fa'apena tali na maua i le nsp9 NMPylation fa'aalia e aofia ai isi NTP (Ata 3D ma le SI fa'aopoopo, Ata S3), fa'amaonia ai o a'afiaga mata'utia i sui fa'atatau amino acid e tuto'atasi mai le ituaiga nucleotide co-substrate fa'aaogaina.Na sosoo ai, na matou faʻataʻitaʻia le aʻafiaga o nei suiga o le nsp12 i luga o le toe faia o coronavirus i le aganuu.I lea itu, sa matou fa'aogaina fa'ata'ita'iga fa'akomepiuta DNA (cDNA) fa'akomepiuta talafeagai na fa'aputuina i fa'ama'i tui tui (23, 24) e fa'aliliu ai sela e 5 -7.O le fa'avasegaina o fa'ama'i fa'ama'i fa'ama'i na maua i totonu o nei sela na fa'aalia ai le tele o mutants HCoV-229E NiRAN e le mafai (Ata 3E).O se vaega o mutants viral e le mafai ona ola e aofia ai isi mea ua faʻaalia e faʻaumatia pe faʻaitiitia ai le faʻaitiitia o le NMPase gaioiga i vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), ae e lua isi mea e sui ai (K4116R, E4145A) 8 % fa'apolopolo?O latou in vitro NMPylation gaoioiga e taʻu mai ai o loʻo aʻafia ai faʻatapulaʻa faʻatapulaʻa.E fa'apena fo'i, e lua isi suiga (R4178K, F4281A) na mafua ai le fa'aitiitia o le fa'aitiitiga fa'aitiitiga a le NiRAN's in vitro NMPylation gaioiga na maua ai siama ola, peita'i, o nei viruses na matua fa'aitiitia ai titers e ala i le toe faia.E ogatasi ma fa'amaumauga o gaioiga in vitro o lo'o fa'aalia i le Ata 3D, e sui ai isi toega se fa e le o fa'asaoina i le coronavirus ma/po'o isi fa'ama'i fa'amo'amo'a (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) fa'atupuina fa'ama'i aoga O le fanau, e ui ina iai ose fa'aitiitiga fa'aitiitiga fa'atusatusa ile fa'ama'i fa'ama'i (Ata 3E).
Ina ia mafai ona suʻesuʻe pe faʻalagolago le gaoioiga a le NMP i le NRAN-mediated i le RdRp domain, o le toega Asp e lua o loʻo aʻafia i le faʻamaopoopoina o ion uʻamea divalent (11) i le RdRp motif C na suia e Ala. o lana galuega nsp9 NMPylation, e faʻaalia ai o le nsp12-mediated in vitro nsp9 NMPylation activity e le manaʻomia ai le polymerase (SI Faʻaopoopo, Ata S4).
Ina ua uma ona faʻatuina le nsp9-specific NMP transferase activity mo nsp12, sa matou taumafai e faʻaalia le NMP-nsp9 faʻapipiʻi e ala ile tele spectrometry (MS).Ole alaleo atoa ole polotini ole recombinant HCoV-229E nsp9 na maua ai le maualuga ile 12,045 Da (Ata 4A).O le faʻaopoopoga o le nsp12 e leʻi suia ai le lelei o le nsp9, e faʻaalia ai o le nsp12 ma le nsp9 o le a le fausia se faʻalavelave faʻamautu i lalo o tulaga faʻaaogaina (denaturation) (Ata 4A).I le i ai o le UTP ma le GTP, o le fuaina o le tele o le tali o loʻo i ai le nsp9 ma le nsp12 na faʻaalia ai o le protein mass o le UTP na siitia 306 Da, ma le protein mass o le GTP na siitia 345 Da, o loʻo faʻaalia ai o nsp9 mole taʻitasi e fusifusia se UMP poʻo le GMP. (Ata 4) C ma le D).O loʻo faʻapea o le malosi e manaʻomia mo le NiRAN-mediated nsp9 NMPylation e sau mai le NTP hydrolysis ma le pyrophosphate faʻamalolo.E ui o le 10-fold molar sili atu o le nsp9 (target) nai lo le nsp12 (enzyme) sa faʻaaogaina i lenei tali, toetoe lava a maeʻa le NMPylation o le nsp9 na matauina, e faʻaalia ai o le fegalegaleaiga i le va o le nsp12 ma le nsp9 e puupuu, ma le nsp12 e mafai ona NMPylate sili atu nsp9 i vitro mole.
Ole NMPylation tasi ole nsp9 ile i ai ole nsp12 ma le UTP poʻo le GTP.O lo'o fa'aalia le fa'amuta atoa o alaleo polotini o HCoV-229E nsp9 (SI fa'aopoopo, Laulau S1) (AD).(A) nsp9 na'o, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 i luma o UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 i luma o le GTP.
Ina ia fuafuaina le nsp9 toega UMPylated e nsp12, nsp9-UMP na vavaeina i trypsin.O peptide na maua na tu'u'ese'ese e le nano-high performance liquid chromatography (HPLC) ma su'esu'eina e tandem mass spectrometry (MS/MS) luga ole laiga.O suʻesuʻega o faʻamatalaga e faʻaaoga ai le polokalame Byonic software (Protein Metrics) na faʻaalia ai le UMPylation o le N-terminal amino acid.E fa'amaonia ma le lima lea.O le fusi o alaleo o le peptide muamua [UMP] NNEIMPGK (SI faʻaopoopoga, Ata S5A) na faʻaalia ai se vaega i le 421 m / z, e faʻaalia ai o le UMP e fusifusia i le toega 1 o le nsp9.
I le N-terminus o le nsp9, Asn o loʻo faʻasaoina i totonu o sui o Orthocoronavirinae (SI faʻaopoopoga, Ata S6).E ui lava matou te talitonu o le N-terminal primary amine nitrogen o le sili lea ona taliaina mo le UMP, na matou filifili e maua mai faʻamaoniga faaopoopo o le NMP o loʻo fusifusia i le N-terminal.Mo lenei mafuaʻaga, o le non-NMPylated ma le NMPylated N-terminal peptide nsp9 faʻamamaina e le HPLC na maua mai i le i ai o le acetone ma le sodium cyanoborohydride.I lalo o nei tulaga, e na'o amine muamua e leai se totogi e mafai ona suia i le propyl (25).O le N-terminal nsp9-derived peptide ma le faasologa NNEIMPGK o loʻo i ai ni amine autu se lua, tasi i le N-terminus o Asn ma le isi i le filifili pito o Lys i le C-terminus.O le mea lea, e mafai ona faʻafeiloaʻi vaega propyl i pito uma e lua.O chromatograms ion ua maua mai o peptides e le o NMPylated o loʻo faʻaalia i le faʻaopoopoga SI, Ata S5B.E pei ona faʻamoemoeina, N-terminal ma C-terminal (mono) propylated (SI faʻapipiʻi, Ata S5B, laina pito i luga) ma peptides dipropylated (SI faʻapipiʻi, Ata S5B, laina pito i lalo) e mafai ona iloa.O lenei mamanu e suia i le faʻaaogaina o le NMPylated N-terminal peptide o le nsp9.I lenei tulaga, e naʻo le C-terminal propylated peptides e mafai ona iloa, ae o N-terminal propylated peptides ma dipropylated peptides e le o iloa (SI Appendix, Figure S5C), e faʻaalia ai ua siitia atu le UMP i le N-terminal primary amine Ina ia puipuia lenei mea. vaega mai le faia o suiga.
O le isi, matou te sui (faʻatasi ma Ala poʻo Ser) poʻo le tapeina o toega faʻasao i le N-terminus o le nsp9 e faʻamalamalama ai faʻalavelave faʻapitoa.Faʻavae i luga o matou faʻamatalaga MS o loʻo faʻaalia ai o le NiRAN o loʻo faʻapipiʻiina le nsp9-NMP faʻatasi ma le amine muamua o le N-terminal toega o le nsp9, matou te manatu o le nsp9 NMPylation e manaʻomia ai le viral master protease (Mpro, nsp5) e faʻasaʻo le nsp9 N-terminal mai. lona polyprotein muamua.Ina ia faʻataʻitaʻiina lenei manatu, matou te gaosia se polotini muamua nsp7-11 o loʻo i ai le nsp9 i le E. coli ma faia se suʻega NMPylation faʻataʻitaʻiga i le i ai o le [α-32P] UTP (meafaitino ma metotia).E pei ona fa'aalia i le Ata 5A (ala 3), e le'o fa'ailogaina le nsp7-11 e le'i tipiina i le nsp12.I se faʻatusatusaga, afai o le nsp7-11 e vavaeina e le recombinant nsp5 e faʻasaʻo ai le nsp9 (ma isi nsps) mai le mea muamua, o le radiolabeled protein e faimalaga ma le nsp9 ua iloa, faʻamaonia la matou faaiuga o le NiRAN ma le N- Selective formation of covalent nsp9-NMP adducts. .Ole amine autu ole N-terminal Asn (tulaga 3825 ile pp1a/pp1ab).O lenei fa'ai'uga o lo'o lagolagoina fo'i e fa'ata'ita'iga e fa'aaoga ai le nsp9 construct, lea e aofia ai se tasi pe lua fa'aopoopo fa'aopoopo i le N-terminus.I tulaga uma e lua, o le NiRAN-mediated UMPylation o le nsp9 na faʻaumatia (SI Faʻaopoopo, Ata S7).O le isi, matou gaosia se polotini ma le tasi pe lua Asn toega na tapeina mai le 3825-NNEIMPK-3832 peptide sequence i le N-terminal o le nsp9.I tulaga uma e lua, na poloka atoa le nsp9 UMPylation (Ata 5B), ma tuʻuina atu faʻamaoniga faaopoopo o le nsp9 N-terminus moni o loʻo galue o se tagata e tali atu i le NMP.
Le faʻaogaina o le proteolytic o le nsp9 ma le matafaioi a N-terminal toega i le nsp12-mediated UMPylation.(A) nsp9 UMPylation e manaʻomia se nsp9 N-terminal e leai se totogi.Nsp7-11-His6 o loʻo muamua faʻapipiʻiina i le 30 °C i le NMPylation detection buffer o loʻo i ai le UTP i le i ai poʻo le leai o le Recombinant Mpro (nsp5-His6).A maeʻa le 3 itula, amata le suʻega NMPylation i le faʻaopoopoina o le nsp12-His6 e pei ona faʻamatalaina i Mea ma Metotia.O le tali e aofia ai le nsp5-His6 (lane 1) ma le nsp9-His6 (lane 2) na faʻaaogaina e fai ma pule.Ina ua maeʻa le 10 minute, na faʻamutaina le tali ma faʻamavae le faʻafefiloi o tali e le SDS-PAGE.O le polotini na pisia i le Coomassie Brilliant Blue (A, pito i luga).O le Nsp7-11-His6 precursor ma le gaosiga o oloa e maua mai i le nsp5-His6 mediated cleavage o loʻo faʻaalia i le itu taumatau.Faamolemole ia matau (ona o le laʻititi laʻititi) o le nsp7 ma le nsp11-His6 e le mafai ona iloa i lenei gel, ma o le tali e faʻaopoopoina i le nsp5-His6 (lanes 1 ma le 4; o le tulaga o le nsp5-His6 o loʻo faʻaalia e se liʻo malosi) poʻo le nsp9-His6 (Lane 2) o loʻo i ai se vaega itiiti o le MBP (faʻaalia i liʻo matala) e pei o ni mea leaga o loʻo totoe ona o loʻo faʻaalia o le MBP fusion proteins (SI faʻapipiʻi, Laulau S1).(B) O le Nsp9-His6 variant e leai se tasi pe lua N-terminal Asn toega (toe faanumera e tusa ai ma le tulaga i le pp1a / pp1ab) ma faʻamamāina ma faʻapipiʻiina i le nsp12-His6 ma le [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE ua pisia i Coomassie o loʻo faʻaalia i le pito i luga, B, o le autoradiograph tutusa o loʻo faʻaalia i lalo.O le tulaga o le faʻailoga mole mole mamafa (i kilodaltons) o loʻo faʻaalia i le agavale.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-terminal fa'asaoina toega na suia i Ala po'o Ser, ma o le aofa'i tutusa o porotini na fa'aaogaina i le nsp12-His6 mediated UMPylation reaction.O oloa tali na vavaeeseina e le SDS-PAGE ma pisia i le Coomassie Brilliant Blue (C, pito i luga), ma le radiolabeled nsp9-His6 na iloa e le phosphorescence imaging (C, ogatotonu).O le faʻaaogaina o le vao-ituaiga (wt) protein e fai ma faʻamatalaga (seti i le 100%), o le gaioiga o le NMPylation (mean ± SEM) na faʻatatauina mai suʻega tutoatasi e tolu.(D) Titers virus i le p1 cell culture supernatant o Huh-7 sela ua a'afia i sela HCoV-229E wild-type Huh-7, ma mutants o lo'o tauaveina le sui amino acid ua filifilia i le nsp9 na fuafuaina e ala i le su'esu'eina o le plaque.O le fa'asologa o le RdRp motif C fa'alua mutant DD4823/4AA na fa'aaogaina e fai ma pule le lelei.
O le N-terminus o le nsp9 (aemaise lava tulaga 1, 2, 3, ma le 6) e matua faʻasaoina i totonu o sui o le aiga o Orthocoronavirinae (SI faʻaopoopoga, Ata S6).Ina ia mafai ona suʻesuʻeina le tulaga talafeagai o nei toega i le nsp12-mediated nsp9 NMPylation, e lua faʻasologa o Asn i le N-terminus o le nsp9 na suia i Ala poʻo Ser (naʻo ia pe faʻatasi).Pe a faʻatusatusa i le vao-ituaiga nsp9, sui N3825 ma Ala poʻo Ser na iʻu ai i le sili atu ma le faʻalua faʻaititia i le nsp12-mediated UMPylation (Ata 5C).E ogatasi ma la matou faaiuga o le NMPylation e tupu i le N-terminal primary amine nai lo le filifili pito o le N-terminal toega, matou te matauina le tele o le NMPylation faʻatasi ma le sui o le N3825A ma le N3825S.O le mea e malie ai, afai e suia le Asn lona lua e Ala poʻo Ser, o le nsp9 UMPylation e faʻaitiitia le malosi (sili atu i le 10 taimi), ae o le sui o Ala i tulaga 3, 4, ma le 6 e naʻo le faʻaogaina o le nsp9 UMPylation (Ata 2). ).5C).O fa'ai'uga tutusa na maua mai i le fa'aaogaina o le ATP, CTP po'o le GTP (SI fa'aopoopo, Ata S8).Faʻatasi, o nei faʻamaumauga o loʻo faʻaalia ai le matafaioi autu a le N2826 (tulaga 2 i le nsp9) i le nsp9 NMPylation.
Ina ia mafai ona maua faʻamaoniga faaopoopo o le fesoʻotaʻiga galue i le va o le N-terminus o le nsp9 ma le NMPylation, matou te faia se faʻasologa faʻasologa e tele (MSA) o le nsp9 faʻasologa o le aiga o Coronavirus (eseese i le va o 104 ma 113 toega) (SI Faʻaopoopo, Ata. S6 ).I le aofa'i, i le 47 (ua iloa ma fa'ailoa) ituaiga o 5 genera o le Orthocoronavirinae subamily o lo'o a'afia ai mameme eseese, manufelelei, ma manu fetolofi, e na'o le 8 toega i le aofa'i na maua e le fesuisuia'i.O suiga sili ona tele, e aofia ai le tapeina ma le faʻaofiina, na matauina i le taamilosaga i le va o elemene fausaga lona lua o le nsp9, e pei ona fuafuaina e suʻesuʻega faʻavae muamua (26 ??28).E lima mea fa'aletonu na maua i le β strand ma le α helix o le C-terminal vaega o le nsp9.E tolu mea fa'aletonu e aofia ai le NNE motif o le N fa'ai'uga o le nsp9.Ua fa'ailoa mai o le Asn lona lua o lenei motif e na'o le pau lea o mea e totoe, lea o lo'o fa'asoa fo'i e le hypothetical nsp9 o le rane coronavirus, ma o lo'o fa'atusalia ai le Microhyla letovirus 1 ituaiga i le subfamily Letovirinae o Alphaletovirus.O le fa'asaoina o toega i le nsp9 elemene fausaga lona lua e mafai ona fa'asalaina e ala i iloiloga fa'avae e fa'amautu ai le gaugau po'o le iloa o mea e fusifusia ai le RNA.Ae ui i lea, o lenei manatu e foliga mai e le faʻaaogaina i le faʻasaoina o le NNE, ma aʻo leʻi faia lenei suʻesuʻega, o le natura o faʻalavelave e faʻatapulaʻaina ai le fesuiaiga o le faasologa o le tripeptide na matua faʻafefe.
Ina ia mafai ona iloa le taua o le nsp9-NMPylation ma le NNE faʻasao i le coronavirus replication, matou gaosia HCoV-229E mutants, lea e tauaveina se tasi pe faaluaina sui o nsp9 N-terminal toega, e taʻu mai ai o le nsp9 NMPylation e afaina i vitro.Ae tatou te leʻi amataina, matou te taumafai e tali le fesili pe o nei suiga (latalata i le nsp8 | 9 cleavage site) e aʻafia ai le faʻaogaina o le proteolytic o le C-terminal pp1a region.O se seti o nsp7-11 polyprotein constructs o loʻo i ai suiga tutusa i le N-terminus o le nsp9 na gaosia i le E. coli ma tipi i le Mpro recombinant.O le proteolytic cleavage o nofoaga e fa (e aofia ai le nsp9 flanking site) e le afaina tele i soʻo se suiga faʻafeiloaʻi (SI appendix, Ata S9), e le aofia ai suiga faʻavae i nei polotini e faʻalavelave i le Mpro-mediated nsp8 | 9 cleavage (Po o isi) upegatafa'ilagi.
O sela Huh-7 na fa'aliliuina i le genome-umi HCoV-229E RNA, fa'ailoga Ala po'o Ser suitulaga i le NNE tripeptides (N3825, N3826, ma E3827) i le pito o le nsp9 N, e fa'aalia ai o le tele o suiga e oti.Na mafai ona matou laveaʻiina le siama e ala i le suiina o le Ser poʻo Ala o le N-terminal Asn (N2835A poʻo le N2835S), ae le mafai ona toe faʻaleleia le siama ma isi suiga tasi ma faalua i le NNE sequence (N3826A, N3826S, NN3825 / 6AA, NN3825/6SS), E3827A) (Ata 5D).
O nei faʻaiʻuga ua faʻaalia ai o le toe faia o coronavirus i le aganuʻu o le tino e faʻatapulaʻaina (tutusa pe tutusa), faʻatapulaʻaina le suiga masani o nofoaga nsp9 NMPylation i totonu o le tino, ma lagolagoina le matafaioi autu o lenei tali i le taamilosaga o le olaga o coronaviruses.
I le seti mulimuli o faʻataʻitaʻiga, na matou gaosia C-terminal His6 faʻaigoaina SARS-CoV-2 nsp12 ma nsp9, ma lua ituaiga mutant o nsp12 i E. coli.O toega o lo'o galue i totonu o le NiRAN ma le RdRp domains sa fa'aaogaina Ala nai lo (Ata 6A ma le SI fa'aopoopo, Laulau S2).K4465 i le SARS-CoV-2 nsp12 e fetaui ma le K4135 i le HCoV-229E (SI Fa'aopoopo, Ata S2), lea na fa'amaonia e mana'omia mo le gaioiga a le NiRAN ma le HCoV-229E toe faia (Ata 3D ma le E).O lenei toega e tutusa foi ma le faʻamaʻi pipisi EAV nsp9 K94 toega, lea na faʻaalia muamua e manaʻomia mo NiRAN self-UMPylation/self-GMPylation (16).E pei ona fa'aalia i le Ata 6B, o le SARS-CoV-2 nsp12 o lo'o iai le UMP transferase gaioioiga e fa'aaoga ai le nsp9 e fai ma sui, a'o le nsp12_K4465A active site mutant e le o galue.O le sui faalua i le SDD uiga faʻasologa o le RdRp motif C e le aʻafia ai le gaioiga o le UMP transferase (Ata 6B), e faʻaalia ai e leai se aʻafiaga o le RdRp i le nsp9 UMPylation.Na maua faʻamatalaga tutusa e faʻaaoga ai le CTP, GTP ma le ATP (SI faʻaopoopoga, Ata S10).I le aotelega, o nei faʻamatalaga o loʻo faʻaalia ai o le NiRAN-mediated nsp9 NMPylation o loʻo i ai se gaioiga faʻasao i coronavirus e fai ma sui o ituaiga eseese o le orthocoronavirus subfamily.
SARS-CoV-2 nsp12-mediated NMPylation o nsp9.(A) Coomassie stained SDS-polyacrylamide gel o loʻo faʻaalia ai le polotini recombinant faʻaaogaina i le suʻega NMPylation.I le avea ai o se faʻatonuga, o se polotini mutant faʻatasi ai ma le faʻaogaina o nofoaga i le NiRAN domain (K4465A) ma le RdRp domain (DD5152/3AA) o le SARS-CoV-2 nsp12 na faʻaaogaina.Ole numera ole toega e fa'avae ile tulaga ile pp1ab.(B) Autoradiograph o le UMPylation detection e faʻaaoga ai le nsp9-His6 ma le [α-32P] UTP e fai ma sui o le nsp12-His6 (ituaiga vao [wt] ma le mutant).O le mole mole (i kilodaltons) o le polotini ua fa'ailogaina o lo'o fa'aalia i le agavale.
NiRAN domains e masani ona faʻasaoina i Nidovirales (16), e faʻaalia ai latou te faʻapipiʻiina gaioiga faʻamalosi e manaʻomia mo le toe faia o Nidovirus.I lenei suʻesuʻega, na mafai ai ona matou faʻamaonia o le vaega o le NiRAN o le coronavirus e faʻafeiloaʻi le NMP (faʻatupuina mai le NTP) i le nsp9, o se palatini faʻamaufaʻailoga RNA e aʻafia i le faʻasologa o siama (26 ?? 29), e fuafua ai o se faʻamoemoe masani ma paaga a le coronavirus RTC.
O le NiRAN domain e fa'asoaina ni fa'asologa fa'asologa e tolu (AN, BN, ma le CN), o lo'o i ai se numera la'ititi o toega o lo'o fa'asaoina i totonu o aiga uma i le fa'asologa o le Nidovirales monophyletic ae matua'i ese'ese (8, 16).O suʻesuʻega talu ai nei ua faʻaalia ai e fesoʻotaʻi faʻavae i se aiga e le masani ai o protein kinase-like proteins, lea na taʻua muamua o le aiga SelO (17, 19, 22, 30, 31).O polotini e feso'ota'i ma SelO e iai ni gaugau kinase, ae le'o iai ni toega fa'asao sa'o i totonu o kinase masani (22, 32).Faʻavae i luga o le faʻasologa faʻasolosolo o molelaʻau ATP o loʻo fusifusia i le nofoaga galue ma faʻamautu e ala i fegalegaleaiga faʻapitoa, SelO na faʻamaonia ma mulimuli ane faʻamaonia e faʻafeiloaʻi le AMP (nai lo le phosphate) i le protein substrate (22), ae o le isi siama SelO-pei o le protein YdiU talu ai nei na faʻaalia e faʻamalosia ai le faʻapipiʻiina o le UMP i Tyr ma Ona toega o meaʻai polotini eseese (33).
Ina ia faʻamaonia ma faʻalauteleina le vaʻaiga o toega o loʻo galue i luga ole laiga o le coronavirus NiRAN domain, na matou faʻaogaina metotia faʻasolosolo faʻasolosolo ma faʻaliliuga e faʻatino ai suʻesuʻega suiga ile coronavirus nsp12 (Ata 3D ma E ma SI faʻaopoopoga, Ata S3 ma le laulau) S1â S4).O faʻamaumauga o loʻo faʻaalia ai o le suia o le HCoV-229E K4135, R4178 ma le D4280 faʻatasi ma Ala e faʻaumatia ai in vitro NMP transferase gaioiga ma faʻasologa o siama i le aganuʻu cell (Ata 3D ma E ma SI faʻapipiʻi, Ata S3), lagolagoina lo latou i ai i le NTP γ-phosphate. ( K4135, R4178) ma le faʻamaopoopoina o ion uʻamea o loʻo galue (D4280).O le suiga o le E4145A o le Glu faʻasaoina i le tele o le siama o le ofaga o manu na valoia e faʻamautu ai le tulaga K4135 (17) na faʻaalia e faʻaumatia ai le faʻaogaina o viral, ae o le mea e ofo ai, na taofia le gaioiga i le in vitro NMPylation assay (Ata 3D ma E ma SI fa'aopoopoga, Ata S3 Ma Laulau S1–S4).O se faʻamatalaga tutusa na faia ina ua faʻafeiloaʻi le suiga tutusa i le YdiU homolog o Salmonella typhimurium (E130A) (33).A tu'ufa'atasia, o nei fa'amaumauga e lagolagoina ai le fa'atonuga o galuega a lenei toega fa'asao nai lo le galuega fa'anatinati.
O le suia o le vaega totoe o le Phe (F4281A) i totonu o le tele o nestovirus i le HCoV-229E NiRAN domain (8) na mafua ai le faʻaitiitia o le galuega NMPylation in vitro ma le faʻaitiitia tele o le faʻaogaina o siama i le aganuu (Ata 3D, E ma SI) fa'aopoopoga, Ata S3).O fa'amaumauga o lo'o ogatasi ma le taua fa'atonutonu galuega a lenei toega, e pei o le DFG motif Phe toega fa'aalia muamua.I kinases polotini masani, o se vaega o le Mg2+ fusifusia matasele ma fesoasoani e faʻapipiʻi ma faʻatonutonu le tui???Manaomia mo le faʻaogaina lelei o gaioiga (32, 34).Suia Ala ma Arg mo K4116 toega (i le preAN motif), i le faasologa, faʻaumatia viral replication ma, e pei ona faʻamoemoeina, na i ai aafiaga eseese i le NMP transferase gaoioiga in vitro, e faalagolago i le amino acid filifili faʻafeiloaʻi (Ata 3D Ma E ma SI faʻaopoopoga. , Ata S3).O faʻamaumauga faʻatinoga e ogatasi ma faʻamatalaga faʻatulagaina, e faʻaalia ai o lenei toega ua faʻatuina se fegalegaleaiga ma le ATP phosphate (17).I totonu o le NiRAN domain o isi aiga faʻamaʻi faʻapipiʻi, o le tulaga o le HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 o loʻo nofoia e Lys, Arg poʻo Lona (8), e faʻaalia ai ua faʻamalieina le faʻatapulaʻaina o galuega o lenei toega patino.O le suia o le D4188A ma le D4283A e faʻaumatia pe faʻaitiitia malosi ai le gaioiga o le enzyme ma faʻaumatia ai le faʻaogaina o siama (Ata 3).O nei toega e lua o lo'o fa'asaoina i le tele (ae le o mea uma) fa'apipi'i fa'ama'i (8), o lo'o fa'ailoa mai ai se galuega fa'apitoa fa'apitoa a le aiga ae atonu e le fa'amamafa.Ala suitulaga o le tele o isi Lys ma Asp toega (K4113A, D4180A, D4197A ma D4273A) e le o faasaoina i le Coronaviridae po o isi Nestioviridae aiga (8) sa faaaogaina e avea ma pule.E pei ona faʻamoemoeina, o nei suiga e tele lava ina faʻamalieina, faʻatasi ai ma sina faʻaititia o le enzyme activity ma viral replication i nisi tulaga (Ata 3 ma SI faʻaopoopoga, Ata S3).I le aotelega, o faʻamaumauga o le mutagenesis o le coronavirus e matua ogatasi lava ma le GMP ma le faʻaliliuina o faʻamatalaga genetics o le EAV NiRAN-RdRp (16), lea o loʻo galue ai le EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortholog) K94 (e fetaui ma le HCoV-229E K4135), R124 (tutusa ma R4178), D132 (tutusa ma D4188), D165 (tutusa ma D4280), F166 (tutusa ma F4281).E le gata i lea, o le HCoV-229E mutagenesis data o loʻo ogatasi ma faʻalautele mai le SARS-CoV reverse genetics data (16), e tutusa lava ma mea na matauina mo le CN motif Phe-to-Ala mutant SARS-CoV_nsp12 The phenotype faʻamatalaina -F219A ma HCoV-229E_F4281A (Ata 3 D ma E ma SI faʻaopoopoga, Ata S3 ma le Laulau S1-S4).
Pe a faʻatusatusa i le EAV orthologs (16), o loʻo i ai le manaʻoga manino mo le UTP ma le GTP (i le self-NMPylation reaction), o la matou suʻesuʻega e faʻaalia ai o le coronavirus NiRAN domain (faʻatusalia e HCoV-229E ma SARS-CoV-2) e mafai ona lelei. fesiita'i uma NMP e fa, e ui lava e iai sina fa'amoemoega mo le UMP (Ata 1 ma le 3).O le tulaga maualalo maualalo o le NTP co-substrate faʻapitoa e ogatasi ma le SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 supercomposite fausaga talu ai nei, lea e fusifusia ai le ADP-Mg2+ i le nofoaga galue o le NiRAN, ae le o le adenine Vaega. o le faʻavaeina o fegalegaleaiga faʻapitoa (17).I la matou suʻesuʻega, o le ituaiga o nucleotide o loʻo faʻaaogaina i le tali NMPylation e leai sona aafiaga faʻapitoa i le gaioiga o le mutant protein (SI Appendix, Ata S3), e faʻaalia ai e leai se tasi o nei toega e vavalalata vavalalata ma le fusifusia o se nucleobase patino.O le fa'avae fa'avae ma le taua fa'ale-natura o le NTP su'esu'e tu'ufa'atasi mana'oga o lo'o va'aia i totonu ole vaega ole NiRAN ole coronavirus ma fa'ama'i fa'aola e tumau pea ona su'esu'eina;atonu e moni pe atonu foi ona o tapulaa o a latou suesuega.I le taimi nei, e le mafai ona faʻateʻaina e faapea, o le gaioiga o le NMPylator o le faʻamaʻi pipisi o le NiRAN domain (faʻatusatusa i le gaioiga muamua o le NMPylation) o loʻo i ai se isi mea e fiafia i ai, i le amanaia o le tutusa i le va o le arterial ma le coronavirus. NiRAN domain ua i lona tapula'a.Fa'asologa-fa'atatau Fa'atusatusa (16).Pe a fa'atusatusa i le pseudokinase SelO, lea e fa'aogaina ai le Mg2+ e fai ma fa'atasi, o le gaioiga o le coronavirus ma le fa'ama'i pipisi o le NiRAN e fa'alagolago i le Mn2 + (16) (Ata 3C ma le SI fa'aopoopo, Ata S1).O le Mn2 + faʻalagolago ma le manaʻo manino mo le UTP o se mea e le masani ai o le protein NMPylators, ma e leʻi leva ona faʻamaonia i le YdiU protein o Salmonella typhimurium, lea e faʻamalosia ai le Mn2 +-faʻalagolago i le protein chaperone UMPylation e puipuia ai sela mai le faʻalavelave faʻalavelave Cell ATP pool ( 33).
O le faʻamatalaina lata mai o le faʻatusa tutusa i le va o le coronavirus NiRAN domain ma cellular protein kinases (17, 19) e maua ai le lagolago faaopoopo mo le mafai e NiRAN ona fesoʻotaʻi faʻatasi le NMP i isi polotini na matou lipotia i lenei suʻesuʻega.Na taula'i la matou su'esu'ega mo ni fa'amoemoega NiRAN i luga o polotini ua fa'ailogaina e le HCoV-229E ORF1a, lea e iloa e fesoasoani tu'usa'o pe leai fo'i le RTC's ORF1b-encoded replicase (12, 35).O a matou suʻesuʻega e tuʻuina atu ai faʻamaoniga mautinoa mo le aoga ma faʻapitoa NMPylation o le nsp9 (Ata 2).Afai e fa'aogaina le porotini fa'atatau i se molar e sili atu i le 8 i le 10 taimi e sili atu nai lo le enzyme (nsp12), ua fa'amaonia o le nsp9 ua atoatoa (mono) NMPized (Ata 4).Na matou faʻaiʻuina o le fegalegaleaiga i le va o le nsp12 ma le nsp9 e puʻupuʻu ma o le a le fausia ai se faʻalavelave faʻamautu ma le nsp9 (i le leai o isi vaega o le RTC).O lenei fa'ai'uga e lagolagoina e su'esu'ega feso'ota'iga polotini i le SARS-CoV proteome (35).O suʻesuʻega a MS na faʻamaonia ai le amine muamua o le N-terminal toega o le nsp9 e pei o le NMPylation site (SI appendix, Ata S5).O le faʻavaeina o le faʻamaufaʻailoga phosphoramidate ma le vaega amino N-terminal e faʻamaonia ai le gaioiga o le NMPylation o le NiRAN-mediated mai le Pseudomonas syringae SelO-mediated AMPylation reaction, lea e faʻamalosia ai le faʻavaeina o le O-linked AMP i Ser, Thr, poʻo Tyr toega Peptide adduct ( 22), ma le S. typhimurium YdiU o loʻo faʻapipiʻiina O-soʻotaʻi (ma Tyr) ma N-soʻotaʻi (ma Lana) faʻaopoopoga peptide-UMP.O faʻamatalaga faʻatapulaʻa o loʻo maua i luga o le aiga SelO o polotini o loʻo faʻaalia ai o tagata o lenei aiga protein tele e eseese tele i le faʻavaeina o faʻaopoopoga peptide-NMP.O se matauga manaia lea e tatau ona su'esu'e atili.
O faʻamaumauga na maua i lenei suʻesuʻega na taʻitaʻia ai i matou e faʻapea o le NMPylation o le nsp9 e manaʻomia ai se N-terminus e leai se totogi.I le tulaga o le viral replication, o lenei mea o le a tuʻuina atu e le proteolytic cleavage o le nsp8 | nsp9 nofoaga faʻaogaina i le replicase polyprotein pp1a faʻasalalau e Mpro ma pp1ab.I le tele o coronaviruses, o le eseesega i le va o lenei nofoaga patino (VKLQ|NNEI i HCoV-229E) ma isi uma coronavirus Mpro cleavage sites o le Asn (nai lo le isi toega laiti, e pei o Ala, Ser Po'o Gly) o lo'o nofo P1â???Nofoaga (36).O faʻamatalaga cleavage peptide na maua i suʻesuʻega muamua na faʻaalia ai o le faʻaogaina o le nsp8 | nsp9 site na maualalo ifo nai lo isi nofoaga, e faʻaalia ai 1) o lenei nofoaga faʻapitoa e mafai ona i ai se matafaioi faʻatonutonu i le taimi faʻatulagaina faʻamaopoopoina o le C-terminal. pp1a itulagi, po'o le 2) a O le matafaioi a le fa'asao fa'apitoa nsp9 N-terminus i le toe faia o siama (37).O a matou faʻamatalaga (Ata 5A) na faʻaalia ai o le recombinant form of nsp9 o loʻo tauaveina le N-terminal sequence moni na faʻamaonia lelei e le nsp12.O le N-terminal flanking sequence na aveesea e le factor Xa (nsp9-His6; SI appendix, Table S1) poʻo le Mpro-mediated cleavage (nsp7-11-His6; Figure 5A ma le SI appendix, Table S1).O le mea taua, o le nsp9-o loʻo i ai muamua le nsp7-11-His6 na faʻaalia le tetee i le NMPylation o le nsp12, lea e ogatusa ma a matou faʻamatalaga, e faʻaalia ai o le faʻaopoopoga o le nsp9-NMP ua faia e ala i le N-terminal primary amine (SI appendix, Ata S5) .Ina ia maua se malamalama loloto atu i le tulaga faʻapitoa o le NiRAN substrate, ona matou taulaʻi atu lea i le N-terminal toega o le nsp9.I le leai o isi polotini, e mafai ona fetuutuunai le faʻatulagaina, e puipuia ai i latou mai le iloa i le tulaga le faʻailogaina o le nsp9 (26 28, 38), e faʻaalia ai lo latou faʻatapulaʻaina o suiga faʻale-natura E mafua ona o le faʻasologa taua-faʻapitoa (e le o le fausaga lona lua e fesoʻotaʻi) galuega a le nsp9 N-vaega vaega.Ala suitulaga o toega faasaoina i lenei itulagi (Ata 5C ma D ma SI faaopoopoga, Ata S8) faaalia ai e taua le N3826 mo nsp9 NMPylation in vitro, ae o le N3825A ma le E3827A suitulaga e taitai atu ai i le faaitiitia o le NMPylation, ae le suitulaga M3829A ma P3830A. .E manino lava e afaina ai le nsp9 NMPylation.E ui lava o le suitulaga o le N-terminal Asn (N3825A, N3825S) e naʻo se aafiaga faʻapitoa i le nsp9 NMPylation ma le faʻasologa o siama i le aganuʻu cell (Ata 5C ma D), o le tapeina o se faʻasologa o totoe o Asn mai le N-terminal 3825-NN dipeptide fa'amaonia E fa'ama'i fa'ama'i, e ta'u mai ai e mana'omia le tasi le toega Asn a'o le'i o'o i le isi toega i le N-terminus, e sili ai le Asn, e ui lava e foliga mai e mafai ona fa'amalieina se vaega o mea toega tutusa (Ata 5B, C, ma D).Matou te faʻamaonia o le 3825-NN dipeptide, aemaise o le N3826 faʻasao ma le taua o totoe i totonu o le coronavirus (SI faʻapipiʻi, Ata S6), faʻamautinoa le saʻo ma le faʻatulagaina o le nsp9 N-terminus i le nofoaga galue o NiRAN.
Suia Ala (E3827A) mo le Glu faʻasaoina o aiga laiti uma o loʻo taofia le nsp9 NMPylation in vitro ae faʻamaʻi i siama i le aganuʻu cell (Ata 5C ma D), e faʻaalia ai le galuega faʻaopoopo a lenei toega, mo se faʻataʻitaʻiga, i fegalegaleaiga autu (NMPylated pe le suia. ) nsp9 N-terminus ma isi mea e a'afia i le toe faia o siama.O suiga o le Nsp9 e leʻi aʻafia ai le faiga o le proteolytic o le nsp9 poʻo soʻo se nsps lata ane (39) (SI Appendix, Ata S9), e faʻaalia ai o faʻamaʻi mataʻutia o le tele o suiga o nsp9 na matauina e leʻi mafua mai i le dysregulation o le C proteolytic process-terminal pp1a area .
O faʻamatalaga o loʻo i luga o loʻo tuʻuina atu ai faʻamaoniga a maeʻa togafitiga Mpro-mediated o le nsp8 | 9 cleavage site i pp1a/pp1ab, o le N-terminus o le nsp9 e mafai ona UMPylated (poʻo se vaega faʻaleleia ma se isi NMP).E le gata i lea, o le faʻasaoina lelei o le N-terminus o le nsp9 (e aofia ai le toega Asn tutoʻatasi ma le fesuisuiaʻi i le aiga coronavirus) ma faʻamatalaga faʻasolosolo faʻasolosolo na maua i lenei suʻesuʻega (Ata 3E ma le 5D) na taʻitaʻia ai i matou e faʻamutaina o le nsp9 NMPylation faʻamatalaina. e feso'ota'i fa'ale-natura ma e mana'omia mo le toe faia o le coronavirus.O taunuuga aoga o lenei suiga o loʻo tumau pea e suʻesuʻeina, mo se faʻataʻitaʻiga, e uiga i le faʻamatalaina muamua (e le faʻapitoa) nsp9 (pepa e leʻi faʻaleleia) RNA faʻapipiʻiina (2628).N-terminal NMPylation e mafai foi ona aʻafia ai le fegalegaleaiga a le nsp9 ma le protein poʻo le RNA substrates poʻo le faʻavaeina o faʻapotopotoga eseese e fa.O nei mea na matauina i suʻesuʻega faʻavae ma ua faʻamaonia e fesoʻotaʻi ma le faʻaogaina o le coronavirus, e ui lava aemaise i le leai o I le tulaga o lenei suiga (26- ââ29, 40).
E ui lava e manaʻomia le faʻavasegaina o faʻamatalaga faʻapitoa o le coronavirus NiRAN domain, o matou faʻamatalaga o loʻo faʻaalia ai o le faʻapitoa o le polotini o le coronavirus NiRAN domain e matua vaapiapi.E ui lava o le faʻasaoina o toega nofoaga autu o loʻo galue (8, 16) i le NiRAN domain o aiga uma nidovirus e lagolagoina malosi le gaioiga a le NMPylator faʻasaoina nei polotini, o le faʻamatalaga o le substrate fusifusia toega taga o lenei vaega Faʻasao ma le faʻasao e tumau pea ona faʻaalia. , ma atonu e eseese i le va o aiga eseese o faamoemoega o Nidovirales.E fa'apena fo'i, e le'i fa'amauina le fa'amoemoega talafeagai o isi fa'ama'i fa'amoe.Atonu o ni fa'ailoga mamao o le nsp9 po'o isi polotini, ona o fa'asologa i fafo atu o le fa'asologa e lima e masani ona fa'asaoina i fa'ama'i fa'atosina e itiiti le fa'asaoina (8), e aofia ai le genome array i le va o Mpro ma NiRAN, Faatasi ai ma i latou, nsp9 o loʻo tu i le korona vairusi.
E le gata i lea, e le mafai ona tatou taofiofia i le taimi nei le avanoa o le NiRAN domain e iai faʻaopoopoga (e aofia ai le telefoni feaveaʻi).I lenei tulaga, e taua le taʻua o faʻamaʻi faʻamaʻi faʻamaʻi i totonu o lenei mea o loʻo faʻaalia mai le protein NMPylators (NMPylators) (30, 31) e foliga mai o loʻo i ai "pule faʻatonu"?O le NMP e faʻaogaina le tele o polotini feaveaʻi e faʻatonutonu pe faʻaumatia a latou gaioiga i lalo, ma fai ai se sao i le tele o faʻagasologa o meaola, e pei o le tali atu i le cellular stress ma redox homeostasis (22, 33).
I lenei suʻesuʻega (Ata 2 ma 4 ma le SI Faʻaopoopo, Ata S3 ma S5), na mafai ona matou faʻamaonia o le nsp12 na tuʻuina atu le UMP (NMP) vaega i se tulaga e tasi (faʻasaoina) i le nsp9, ae o isi polotini e leʻi suia i le fa'aaogaina I lalo o aiaiga, e fa'amanino lelei (nai lo le fa'amama) fa'apitoa o mea e lagolagoina.E tusa ai ma lenei, pe a faʻatusatusa i le N-terminal nsp9 NMPylation, o le galuega a le nsp12 lava ia NMPylation e matua maualalo lava, o lona suʻesuʻeina e manaʻomia ai le umi o le taimi e faʻaalia ai le autoradiography, ma e faʻaaogaina le faʻateleina o le 10 i le faʻaogaina o le nsp12.E le gata i lea, o la matou suʻesuʻega MS na le mafai ona tuʻuina atu faʻamaoniga mo NMPylation o le nsp12, lea e taʻu mai ai o le NiRAN domain self-NMPylation (i le mea sili) o se gaioiga lona lua.Ae ui i lea, e tatau ona maitauina o isi suʻesuʻega ua tuʻuina atu ai faʻamaoniga muamua e mafai e le tagata lava-AMPylation tulaga o le siama NMPylator ona pulea a latou galuega NMPylation i luga o isi protein substrates (22, 33).O le mea lea, e manaʻomia nisi suʻesuʻega e suʻesuʻe ai aʻafiaga faʻaogaina o gaoioiga a le tagata lava ia NMPylation lipotia mo EAV nsp9 (16) ma le coronavirus nsp12 (lenei suʻesuʻega), e aofia ai le faʻataʻitaʻiga o le chaperone-pei o le gaugau o le C-terminal RdRp domain ( 16) ).
I le taimi muamua, o le tele o manatu e uiga i galuega e mafai ona faia i lalo o le nidoviral NiRAN domain ua iloiloina, e aofia ai le RNA ligase, RNA-capped guanylate transferase ma le protein priming activity (16), ae leai se tasi oi latou e fetaui ma galuega o loʻo avanoa i lalo.O faʻamatalaga e maua i tulaga nei e tutusa lelei lava le taimi e aunoa ma le faia o faʻamatalaga faaopoopo.O faʻamaumauga na maua i lenei suʻesuʻega e sili ona ogatasi ma (ae le mafai ona faʻamaonia) o loʻo aʻafia le vaega o le NiRAN i le amataina o le faʻaogaina o le RNA faʻapipiʻiina.Na talitonu muamua o le galuega a le NiRAN domain i le 5 ??²-RNA capping po'o RNA ligation reactions e le afaina i nei mea ma le Lagolago o isi fa'amatalaga.O le mea lea, mo se faʻataʻitaʻiga, o le nofoaga galue o le NiRAN ua manatu e aofia ai le Asp faʻasaoina o se faʻavae lautele (D252 i Pseudomonas syringae SelO; D4271 i HCoV-229E pp1ab; D208 i SARS-CoV-2 nsp12) (SI Faʻaopoopo, ata 2 ).S2) (17, 22, 33), ae o le catalysis i le ATP-faʻalagolago i le RNA ligase ma le RNA capping enzyme o loʻo faʻatinoina e le enzyme covalent-(lysyl-N) -NMP intermediate, lea e aofia ai se mea e le suia Lys totoe ( 41).E le gata i lea, o le tulaga faʻapitoa faʻavae faʻasologa o le coronavirus NiRAN mo le faʻasaoina o polotini sini ma le faʻamalieina faʻapitoa mo NTP co-substrates (e sili atu i le UTP) e tetee i le NiRAN-mediated capping enzyme poʻo le RNA ligase-like functions.
E manino lava, e manaʻomia le tele o galuega faʻaopoopo e faʻamaonia ma, pe a faʻamaonia, faʻamalamalama atili i le tulaga talafeagai o le nsp9-UMP (nsp9-NMP) i le protein-induced RNA synthesis, lea o le a faʻafesoʻotaʻi ai le tele o mea manaia ae (e oʻo mai i le taimi nei) lipoti na lipotia muamua. .Va'aiga tu'ufua.Mo se faʻataʻitaʻiga, ua faʻamoemoeina o le iʻuga o le RNA o le coronavirus e amata ile oligo(U) strand (42, 43).O lenei faʻamatalaga e ogatusa ma le manatu o le faʻapipiʻiina o le RNA le lelei e amataina e ala i le fusia o le UMPylated form of nsp9 i le poly (A) siʻusiʻu ( faʻaosoina), lea e mafai ona faʻalauiloaina e lona RNA fusia Le gaioiga ma / poʻo fegalegaleaiga ma isi RTC polotini.O le vaega UMP na saunia e le nsp9 e mafai ona faʻaaogaina e fai ma "primer" mo le nsp7/8/nsp12-mediated oligouridylation, e faʻaaoga ai le 3??²-poly(A) siʻusiʻu i le genomic RNA poʻo le isi oligo (A) -o loʻo iai le faasologa. e avea o se faʻataʻitaʻiga, e tutusa ma le masini na faʻatuina mo le picornavirus VPg protein (44).Ae fa'afefea pe afai o le talosaga e "le-fa'atonu"????O le amataina o le (protein-induced) negative-strand RNA synthesis e maua ai se soʻotaga i faʻamatalaga, e faʻaalia ai o le coronavirus negative-strand RNA o loʻo i ai le UMP (nai lo le UTP) i lona pito (42), lea e manatu e faʻaalia ai o le nucleic acid Dicer e tipiina le pito phosphorylated e se endonuclease faapitoa uridine e le iloa.Afai e fa'amaonia, e mafai ona fesoasoani lenei gaioioiga nucleic acid hydrolytic fa'asa'oloto le oligomeric UMPylated fomu o le nsp9 mai le 5 ² pito o le strand le lelei.O le matafaioi a le nsp9 i le protein priming o loʻo ogatasi foi ma suʻesuʻega faʻataʻitaʻiga muamua, lea na faʻaalia ai o le nsp9 (ma le nsp8) e fegalegaleai faʻapitoa ma faʻapitoa ma le elemene cis-acting RNA e lata ane i le 3 pito o le coronavirus genome.45).E tusa ai ma lenei lipoti, o nei faʻamatalaga talu ai e mafai nei ona toe suʻesuʻeina ma faʻalauteleina e ala i nisi suʻesuʻega.
I se aotelega, o matou faʻamaumauga na faʻamautu ai le gaioiga faʻapitoa a se faʻailoga faʻamaʻi faʻamaʻi faʻamaʻi e fesoʻotaʻi ma RdRp i le N-terminus.I le coronavirus, o lenei mea fou na maua e le NiRAN-mediated UMPylator/NMPylator gaoioiga e faʻaogaina e faʻalagolago i le Mn2 + ma isi Asn e lata ane ma mafua ai le faʻavaeina o sootaga (maualalo-malosi) phosphoramidate ma le N-terminal primary amine.E ala i le faʻaogaina o le Mpro-mediated i le nsp8 | 9 cleavage site, e mafai ona faʻaogaina le target nsp9 mo NMPylation, e faʻaalia ai le fesoʻotaʻiga i le va o le protease ma le NiRAN domain, lea e oʻo atu i le RdRp.O le faʻasaoina o toega autu i le nsp12 NiRAN nofoaga galue ma le nsp9 target, tuʻufaʻatasia ma faʻamaumauga na maua mai le lua coronaviruses e aofia ai le SARS-CoV-2, e maua ai le faʻamaoniga malosi o le nsp9 NMPylation o se coronavirus O foliga faʻasao o se laʻasaga autu foi i le faʻasologa o siama.O faʻamatalaga o loʻo maua e taʻitaʻia ai i tatou e faʻamaonia o le matafaioi faapitoa a le NMPylated form of nsp9 i le protein-induced RNA synthesis o se faʻataʻitaʻiga talafeagai mo le coronavirus ma isi faʻamaʻi faʻapipiʻi, ma e mafai foi e NiRAN ona taulaʻi i isi polotini e le o iloa.Pulea le siama.Fegalegaleaiga talimalo.Afai e faʻamaonia, o le aʻafia o mea faʻavae polotini i le viral RNA synthesis o le a faʻateleina ai le faʻasologa o fesoʻotaʻiga o le Mpro / 3CLpro ma RdRp domains i le va o le coronavirus ma le picornavirus-like supergroup (9), lea ua tuufaatasia nei i Pisonivirites talu ai nei. 46) i le vaega.
O a matou faʻamaumauga o loʻo faʻaalia ai foʻi o gaioiga faʻavae, filifilia ma le faʻasao o le enzyme o loʻo faʻaalia i lenei suʻesuʻega e mafai ona faʻaaogaina e fai ma sini mo vailaʻau faʻamaʻi.O mea faʻalavelave e faʻalavelave i le fusifusia (ma suiga mulimuli ane) o le nsp9 N-terminus faʻasaoina i le nofoaga galue o NiRAN e mafai ona atiaʻe e avea ma vailaʻau faʻamaʻi lelei ma sili ona lelei, talafeagai mo le togafitiga o manu ma tagata coronavirus mai ituaiga (sub)genus Infections eseese. , e aofia ai le SARS-CoV-2 ma Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus.
O le faʻasologa o le faʻasologa o le coronavirus polotini na gaosia i lenei suʻesuʻega na faʻalauteleina e le RT-PCR e faʻaaoga ai le RNA vavae ese mai le Huh-7 na aʻafia i le HCoV-229E poʻo le Vero E6 na aʻafia i le SARS-CoV-2, ma faʻaofi i le faʻaogaina o faiga masani faʻapipiʻi.pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) poʻo le pASK3-Ub-CHis6 (47) faʻamatalaga vector (SI Faʻaopoopo, Laulau S1 ma S2).Na fa'aofiina le suitulaga o le codon e tasi e ala ile PCR-fa'atonu-fa'asinoala mutagenesis (48).Ina ia maua le MBP fusion protein, E. coli TB1 sela na suia ma le pMAL-c2 plasmid construct talafeagai (SI appendix, Table S1).O le polotini fusu'aga na fa'amamāina e le amylose affinity chromatography ma fa'amama i le fa'ailoga Xa.Mulimuli ane, o le C-terminal His6-tagged protein na faʻamamaina e le Ni-immobilized metal affinity chromatography (Ni-IMAC) e pei ona faʻamatalaina muamua (49).Ina ia maua le ubiquitin fusion protein, E. coli TB1 sela na faʻaogaina le pASK3-Ub-CHis6 plasmid construct (SI Faʻaopoopo, Laulau S1 ma S2) ma le pCGI plasmid DNA faʻapipiʻi ubiquitin-specific C-terminal hydrolase 1 (Ubp1).Suiga (47).O le C-terminal His6-tagged coronavirus protein na faʻamamaina e pei ona faʻamatalaina muamua (50).
O le su'ega a le tagata lava ia NMPylation o HCoV-229E nsp12-His6 na faia e pei ona faamatalaina i le EAV nsp9 (16).I se faapuupuuga, o le nsp12-His6 (0.5 μM) o loʻo i ai le 50 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) -KOH, pH 8.0, 5 mM dithiothreitol (DTT), 6 mM MnCl2, 25 µM buffer. o le NTP ma'oti ma le 0.17 µM e fetaui ma le [α32-P]NTP (3,000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) ile 30 °C mo le 30 minute.I isi uma (tulaga masani) suʻega NMPylation o le nsp12-mediated nsp9 NMPylation, o tulaga faʻaalia e fetuunai e pei ona taua i lalo: nsp12-His6 (0.05 μM) ma le nsp9-His6 (4 μM) i le i ai o le 50 mM HEPES-KOH (pH 8.0). ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM fa'ailoa NTP, ma 0.17 µM fetaui [α32-P]NTP.A maeʻa ona faʻapipiʻiina mo le 10 minute i le 30 ° C, na faʻafefiloi le faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga ma SDS-PAGE sample buffer: 62.5 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane HCl (pH 6.8), 100 mM DTT, 2.5% SDS, 10% glycerol ma 0.005% bromophenol lanu moaga.O le polotini na faʻamalo e ala i le faʻamafanafanaina i le 90 °C mo le 5 minute ma vavae ese e le 12% SDS-PAGE.O le gel e faʻapipiʻiina ma faʻafefeteina i le Coomassie Brilliant Blue solution (40% methanol, 10% acetic acid, 0.05% Coomassie Brilliant Blue R-250), faʻamalo, ma faʻaalia i se ata faʻataʻitaʻiga mo le 20 itula (e iloa ai le nsp12 mai le NMPylation) po'o le (maualuga) 2 Itula (e iloilo nsp9 NMPylation).O le Typhoon 9200 imager (GE Healthcare) na faʻaaogaina e suʻesuʻe ai le lau ma ImageJ na faʻaaogaina e iloilo ai le malosi o le faailo.
Mo suʻesuʻega MS, 1 µM nsp12-His6 ma 10 µM nsp9 (e aunoa ma le hexahistidine tag) na faʻaaogaina i le suʻesuʻega NMPylation (SI faʻapipiʻi, Laulau S1) ma faʻaogaina le faʻaopoopoga o le 500 μM UTP ma le GTP.Fa'alagolago i lo latou fa'atonuga ma le lelei o le polotini, o le Waters ACQUITY H-Class HPLC system ua fa'apipi'iina i le MassPrep column (Waters) sa fa'aaogaina e fa'amama ai le 1 i le 10 µL o vaifofo fa'apolotini pa'u i luga o le initaneti.O le polotini fa'amama e fa'aulu i totonu o le puna eletise eletise o le Synapt G2Si mass spectrometer (Waters) e ala i le fa'alili o le pa'u A (vai/0.05% formic acid) ma le buffer B (acetonitrile/0.045% formic acid), ma o le vevela o le koluma e 60 ° C ma le tafe o le 0.1 mL / min: elution isocratically ma le 5% A mo le 2 minute, ona sosoo ai lea ma le laina laina i le 95% B i totonu ole 8 minute, ma tausia le 95% B mo le isi 4 minute.
O ion lelei o loʻo iai le tele o le 500 i le 5000 m / z o loʻo maua.Glu-fibrinopeptide B e fuaina i le 45 sekone mo le faʻasaʻoina o le tele o masini.Fa'aoga masini masini masini MassLynx fa'atasi ai ma MaxEnt1 fa'aopoopoga e fa'ate'a ai le alaleo averesi pe a uma ona toesea le laina fa'avae ma fa'alelei.
O le UMPylated HCoV-229E nsp9 na fa'amamaina e ala i le fa'aopoopoina o sequencing-grade modified trypsin (Serva) ma fa'asusu i le po i le 37 °C.O le Chromabond C18WP spin column (vaega numera 730522; Macherey-Nagel) na faʻaaogaina e faʻamalo ma faʻapipiʻi ai peptides.Mulimuli ane, o le peptide na faʻamavaeina i le 25 μL o le vai, lea e aofia ai le 5% acetonitrile ma le 0.1% formic acid.
O faʻataʻitaʻiga na suʻesuʻeina e MS e faʻaaoga ai le Orbitrap Velos Pro mass spectrometer (Thermo Scientific).Le pito sili nanoâ HPLC faiga (Dionex), fa'apipi'iina i se tu'uga fa'auma tu'u 50 cm ??75 μm C18 RP koluma faʻapipiʻi i 2.4 μm mageta lopa (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Faʻafesoʻotaʻi i le spectrometer tele i luga o le initaneti e ala i le Proxeon nanospray source;tui le 6 µL o le trypsin digestion solution i totonu o le 300 µm totonu x??1 cm C18 PepMap koluma a'o le'i fa'atumauina (Thermo Scientific).O le fa'aaogaina o le vai/0.05% formic acid e fai ma solvent, o le fa'ata'ita'iga na otometi lava ona pu'eina ma fa'a'ese'ese i le tafega ole 6 µL/min.
O gradients nei o le vai/0.05% formic acid (solvent A) ma le 80% acetonitrile/0.045% formic acid (solvent B) na faʻaaogaina e ausia ai le vavaeeseina o peptides tryptic i le tafe o le 300 nL / min: 4% B mo 5 minute, ona 30 A laina laina i le 45% B i totonu o minute, ma le fa'atupuina laina i le 95% solvent B i totonu ole 5 minute.Faʻafesoʻotaʻi le koluma chromatographic i se nano-emitter uʻamea uamea (Proxeon), ma faʻafefe saʻo le eluent i le capillary vevela o le tele spectrometer e faʻaaoga ai le gafatia o le 2,300 V. O le suʻesuʻega suʻesuʻe ma se iugafono o le 60,000 i le Orbitrap mass analyzer e fesoʻotaʻi. faatasi ai ma le itiiti ifo ma le tolu faamaumauga MS / MS suʻesuʻe, dynamically le aofia ai mo 30 sekone, faʻaaogaina laina mailei mailei faʻaoso le dissociation poʻo le maualuga o le malosi faʻalavelave faʻatasi ma le orbitrap detection , O le iugafono e 7,500.
Taimi meli: Au-03-2021